一提起miRNA的發(fā)現(xiàn)，新一代測(cè)序就笑了。RNA-seq這種新技術(shù)發(fā)現(xiàn)，可鑒定SNP、突變和新的miRNA。RNA-seq通常被視為一種篩查技術(shù)。就目前而言，它以一種半定量但極透徹的方式鑒定樣本中的所有序列。當(dāng)然，它價(jià)格不菲，數(shù)據(jù)分析繁復(fù)，并非全部實(shí)驗(yàn)室都有機(jī)會(huì)使用。
qRT-PCR這種經(jīng)典技術(shù)仍然是miRNA表達(dá)譜分析的方法，因?yàn)樗夏乃衅谕簶颖玖康汀㈧`敏度高、特異性好以及動(dòng)態(tài)范圍廣。在單次運(yùn)行中，從10到107個(gè)拷貝的miRNA靶標(biāo)都能準(zhǔn)確定量。一般而言，每次分析需要1 ng總RNA，而miRNome的分析需要1 μg RNA。對(duì)于細(xì)胞系的分析，這點(diǎn)RNA當(dāng)然是小菜一碟，但并非所有研究都那么幸運(yùn)。分選后的細(xì)胞、激光捕獲組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞如此珍貴，未必能實(shí)現(xiàn)。在此，我們就介紹一個(gè)基于PCR的系統(tǒng)，它能將miRNome分析所需的樣本量降低了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)帶來(lái)了出色的重復(fù)性和性。
miRNA的預(yù)擴(kuò)增
這就是來(lái)自QIAGEN的miScript® PreAmp Primer Mixes 。盡管市場(chǎng)上也有一些方法能預(yù)擴(kuò)增miRNA，但miScript PCR System是*一種技術(shù)，包含了真正通用、小RNA特異的cDNA合成反應(yīng)。
在這種技術(shù)中，miRNA被大腸桿菌poly A聚合酶加尾，接著以oligo dT為引物合成cDNA。這確保了所有miRNA都能無(wú)偏向地轉(zhuǎn)化成cDNA。更重要的是，這包括了過(guò)去未曾鑒定的miRNA，讓您在發(fā)現(xiàn)了新的miRNA靶標(biāo)時(shí)能隨時(shí)返回到原先保存的cDNA樣本。在此，RNA的用量不是很關(guān)鍵，但QIAGEN建議cDNA合成反應(yīng)包含10 ng RNA（相當(dāng)于300個(gè)細(xì)胞）。每個(gè)cDNA合成反應(yīng)可用于10次預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，每次1 μl（相當(dāng)于1 ng RNA或30個(gè)細(xì)胞）。更多RNA當(dāng)然也可以，但沒(méi)有必要。更少RNA也并非不行，但若少于3個(gè)細(xì)胞，取樣的差異會(huì)導(dǎo)致中等或低表達(dá)miRNA的結(jié)果發(fā)生變化。
預(yù)擴(kuò)增過(guò)程是一個(gè)高度多重的PCR，以96或384個(gè)分析的形式開(kāi)展，這對(duì)應(yīng)了QIAGEN預(yù)開(kāi)發(fā)的96-和384-分析的miScript miRNA PCR Array。經(jīng)過(guò)12個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增，其產(chǎn)物可與實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液混合，用于miRNA表達(dá)譜分析。無(wú)論是10-20個(gè)拷貝的靶標(biāo)，還是107個(gè)拷貝的靶標(biāo)，如今都增長(zhǎng)了4個(gè)數(shù)量級(jí)。這下，您再也不用擔(dān)心樣本量不夠了。FFPE組織，血液、尿液等體液都能采用這種辦法預(yù)擴(kuò)增。
樣本量是夠了，但預(yù)擴(kuò)增會(huì)不會(huì)影響miRNA表達(dá)譜本身呢？相信這是大家zui關(guān)心的問(wèn)題。如此大量分析的同時(shí)開(kāi)展，確實(shí)是個(gè)難題，但QIAGEN通過(guò)一些設(shè)計(jì)特征使其成為可能。首先，由于miScript PCR System采用通用的3’ PCR引物，預(yù)擴(kuò)增引物庫(kù)的復(fù)雜度立即下降50%。其次，所有的擴(kuò)增子都有著相同的大小和非常接近的Tm，這大大有利于多重反應(yīng)的無(wú)偏向擴(kuò)增。zui后，cDNA合成反應(yīng)的試劑嚴(yán)重限制了cDNA副反應(yīng)，這樣背景cDNA極少，而預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)中的背景也極低。
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