Poly(A)聚合酶使用原理
更新時(shí)間：2023-07-13 點(diǎn)擊次數(shù)：1266次
Poly(A)聚合酶使用原理
描述：本E. coli Poly(A) Polymerase 為高效加A 聚合酶，該酶以RNA為模板在RNA的3′末端加入20~200 個(gè)A堿基?？蓱?yīng)用于增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性，及microRNA 加A 尾，為cDNA 合成提供oligo-dT 引物結(jié)合位點(diǎn)等。該酶以單鏈RNA作為引物，ATP 作為底物進(jìn)行聚合反應(yīng)。
操作方法：
1. 按以下組分配制反應(yīng)體系
E. coli Poly(A) Polymerase(5U/μl) 1 μl
10×EPAP Reaction Buffer 2 μl
10 mM ATP 2 μl
25 mM MnCl2 2 μl
RNA 0.5~10 μg
ddH2O Up to 20 μl
2. 混合均勻后，37°C 反應(yīng)1 小時(shí)。即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：不同的實(shí)驗(yàn)需要加A 的量會(huì)有所不同，可通過(guò)減少反應(yīng)時(shí)間來(lái)調(diào)整加A 的長(zhǎng)度，該酶在37°C 反應(yīng)30 分鐘時(shí)可加30 個(gè)A 堿基，1 小時(shí)可加100 個(gè)A 堿基。
活性定義：
在37℃、pH7.9 的條件下，以ATP 為底物，10 分鐘內(nèi)把1 nmol 的AMP 聚合到RNA 上所需要的酶量定義為1 個(gè)活性單位（U）。
應(yīng)用：
? RNA 3' 標(biāo)記
? microRNA 加A 尾，為cDNA 合成提供oligo-dT 引物結(jié)
合位點(diǎn)
? 增強(qiáng)RNA 穩(wěn)定性
儲(chǔ)存：
-20°C 可保存2 年。
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